Методы анализа кариотипа человека. Стандартные цитогенетические, молекулярно-цитогенетические, молекулярные методы


Как проводится генетический скрининг NGS в программе ЭКО

Перед проведением экстракорпорального оплодотворения с NGS будущие родители должны пройти такую же подготовку и такие же обследования, что и при планировании ЭКО без генетического анализа. Перечень необходимых исследований определяет врач, основываясь на данных семейного анамнеза.

Стимуляция овуляции – это первый этап ЭКО, который должна пройти женщина в программе ЭКО. Стимуляция овуляции проводится при помощи гормональных препаратов, благодаря которым в одном менструальном цикле созревает не одна, как обычно, а несколько яйцеклеток.

Оплодотворение полученных яйцеклеток – второй этап ЭКО. Полученные в результате стимуляции овуляции яйцеклетки извлекают из организма женщины и оплодотворяют спермой в лабораторных условиях.

Третий этап ЭКО – забор клеток для преимплантационной генетической диагностики. Для генетического анализа лаборанты-генетики при помощи высокоточных инструментов берут у эмбрионов несколько клеток. Это делается на пятые сутки после оплодотворения яйцеклеток, когда клетки эмбриона начинают дифференцироваться, разделяясь на «внутриклеточную массу», из которой сформируется будущий ребенок, и на клетки внешнего слоя – трофектодермы. Клетки трофектодермы несут в себе всю генетическую информацию, но не являются, по сути, частью организма будущего ребенка – они принимают участие в имплантации эмбриона в полость матки и формируют плаценту. Поэтому их забор не представляет угрозы для эмбриона.

Генетическая преимплантационная диагностика методом NGS – четвертый этап ЭКО.Взятые для анализа клетки передаются в молекулярно-диагностическую лабораторию, в которой с помощью метода генетической диагностики NGS проводится анализ эмбриона на наличие хромосомных или генных аномалий. Процесс диагностики полностью автоматизирован, что исключает вероятность вторжения в процесс человеческого фактора. Точность проверки на хромосомные или моногенные заболевания составляет около 99,9%.

Криоцикл для эмбриона. Особенностью ЭКО с использованием NGS является необходимость криоконсервации эмбрионов, у которых взяты на анализ несколько клеток. Дело в том, что в лабораторных условиях эмбрион может существовать не более 5-6 суток. А клетки трофектодермы для анализа можно получить не ранее, чем на пятые сутки после оплодотворения, к тому же для проведения анализа методом преимплантационной генетической диагностики NGS также требуется время.

Выходом из ситуации стал метод витрификации – самый современный, эффективный и безопасный способ замораживания эмбрионов. Поэтому сразу после биопсии (забора клеток для генетического анализа) эмбрионы замораживаются, а женщина вступает в предпоследнюю стадию ЭКО – подготовку к имплантации.

Подготовка к имплантации включает в себя дополнительные (по показаниям) обследования, целью которых является определение наиболее оптимального времени для имплантации эмбрионов и наступления беременности. В некоторых случаях врач считает возможным «подсадить» эмбрионы в ближайшем менструальном цикле, иногда эта манипуляция откладывается на 1-2 месяца. Это время может понадобиться для стабилизации после стимуляции овуляции гормонального фона будущей мамы, а также – для проверки готовности эндометрия к имплантации.

Перенос эмбриона в полость матки – заключительный этап ЭКО. Основываясь на результатах анализа преимплантационной генетической диагностики NGS, лаборанты-генетики отбирают наиболее подходящий для имплантации эмбрион. Врач-гинеколог в назначенный день, под контролем УЗИ, осуществляет абсолютно безболезненный перенос эмбриона в полость матки. Дальнейшее течение беременности и родоразрешение не отличаются от такового после естественного зачатия.

Результативность программ ЭКО после начала использования метода преимплантационной генетической диагностики NGS в клинике ISIDA значительно увеличилась и достигает сейчас 70%!

Хотите, чтобы Ваши мечты о материнстве стали счастливой реальностью? Доверьте свое счастье профессионалам! Позвоните нам по телефонам 0 800 60 80 80, +38 (044) 455 88 11 и запишитесь на прием к врачу, который поддержит Вас на пути к Вашей мечте. Или задайте нам свой вопрос онлайн и мы обязательно на него ответим!

Этапы проведения ПГД

Рассмотрим этапы ПГД:

  1. Первый этап начинается со стандартной схемы процедуры ЭКО. Заканчивается процесс этапом пункции яйцеклеток.
  2. Проведение эмбриологической процедуры яйцеклеток и спермы, осуществление микроманипуляций. На третий день культивирования проводится процедура биопсии. Для этого у эмбриона забирают одну клетку с помощью специального микрохирургического инструмента. При биопсии используется механический, химический и лазерный метод. Далее проводят фиксацию бластомера. Кроме этого, может проводиться биопсия трофэктодермы и биопсия полярного тельца ооцита. В первом случаи из трофоэктодермы забирают 3-5 клеток (обычно они приходятся на внешний слой бластоцисты). Проводится биопсия трофэктодермы на 5 или 6 сутки и является достоверным вариантом выявления кариотипа аномального развития эмбрионов. Биопсия тельца ооцитов является самым наилучшим вариантом диагностического исследования при бесплодии с женской стороны. Генетическая информация в полярном тельце и в ядре яйцеклетки одинакова.
  3. Проведение гибридизации ДНК-зондами. Под зондами понимают особую метку. У каждой единичной хромосомы имеется собственная метка. Она подсвечивается цветом под действием флуоресцента. Поэтому их идентификацию легко провести.
  4. Получение визуализированной информации на экране монитора компьютера. Проведение диагностики блостмастеров, которые были зафиксированы. Получение окончательных результатов к 5 дню проведения культивирования. Здесь врачи проводят подсчет количества хромосом. Если их число соответствует принятому значению, то материал рекомендуется к дальнейшему переносу. Если вместо трех хромосом наблюдается две или вместо необходимых двух на экране визуализируется одна, то такой материал переносить не следует, он аномальный.
  5. Перенос генетический здоровых эмбрионов на 5 день культивирования. Это время считается самым оптимальным. Материал для использования представлен в достаточном количестве и процедура биопсии для эмбриона не так травматична. Если перенести материал на третьи сутки, то возникнет высокая вероятность остановки процесса развития. Кроме этого, у трехдневного зародыша генетические клетки сильно отличаются. В результате можно получить ложные исследования.
  6. Проведение криоконсервации после осуществления процедуры переноса.
  7. Диагностирование долгожданной беременности с помощью теста (после подсадки обычно должно пройти две недели).
ПОЛЕЗНАЯ ИНФОРМАЦИЯ:  Как правильно вести себя после переноса эмбрионов при ЭКО

Методы анализа кариотипа человека. Стандартные цитогенетические, молекулярно-цитогенетические, молекулярные методы

Возможные последствия ЭКО с ПГД

Помимо скринингового исследования беременной после ЭКО делают анализ амниотической жидкости и УЗИ нервной системы плода.

В зависимости от метода ПГД на диагностику потребуется от нескольких часов до нескольких дней. Весь цикл ЭКО составляет 4-6 недель. В этот промежуток входит и ПГД.

Процедуру ПГД проводят амбулаторно. Проведение седативной анестезии потребуется только при заборе яйцеклеток.

При ЭКО с ПГД возникают такие же риски, как и при ЭКО без ПГД. Это:

  • Многоплодная беременность.
  • Повреждение эмбриона на этапе изъятия клетки.
  • Реакции на препараты, которые могут применяться при процедуре ЭКО. Это в основном головная боль, приливы крови и изменение настроения в худшую сторону.
  • Наблюдается синдром овариального гипервозбуждения.
  • Кровотечения после изъятия яйцеклетки.
  • Чувствительные спазмы после процедуры изъятия.
  • Исследование ПГД дает не сто процентный результат.
  • Получения зачатия вне матки.

Генетическая диагностика как совершенный метод

Конечно, самый большой страх женщины, это родить генетически нездорового малыша. Метод ПГД позволяет отсеять генетически больных эмбрионов, тем самым сразу дает ребенку здоровье. Родителям не приходится бояться за здоровье долгожданных детей. Если кто-то полагает, что генетические исследования делают ребенка по шаблону, то это не так. Нельзя сотворить дизайнерский проект будущего младенца. Характер и индивидуальность совсем не зависят от полученных генов. Даже клонированные искусственным путем животные не схожи друг с другом. Гены отвечают за внешние данные.

ЭКО совместно с ПГД сильно повлияло на приговор «бесплодны». Точнее, это уже не приговор, а особенное заболевание, которое легко обходится с помощью ЭКО. Метод позволяет преодолеть ряд трудностей со здоровьем, а именно:

  • Непроходимость маточных труб.
  • Отсутствие маточных труб.
  • Истощение яичников.
  • Отсутствие длительное время процесса овуляции.
  • Нарушение работы яичников.
  • Спайки в малом тазу.
  • Отсутствие половых желез.

Даже, если у женщины отсутствует матка, проблему все равно можно решить. Но при этом яичники ее должны нормально функционировать. Для этого у женщины забирают яйцеклетки, оплодотворяют их спермой супруга и помещают зародыш в тело другой женщины (например, родственницы или суррогатной матери).

ПГД абсолютно безопасная процедура. Процедуру диагностики делают на максимально малом сроке, когда из каждой забранной клетки может получиться полноценный организм. Вреда здоровью эмбриона не будет, соответственно, будущий ребенок так же будет здоров.

Генетика продолжает развиваться. Она позволяет заранее получить здоровое потомство и будущих родителей, у которых с большей вероятностью будут отсутствовать генетические заболевания. Взрослый человек реально оценивает будущее, он заранее хочет дать малышу полноценную жизнь и в дальнейшем от него получить потомство (внуков). Генетика в этом, безусловно, помогает.

ПОЛЕЗНАЯ ИНФОРМАЦИЯ:  Плодное яйцо размеры по неделям

Итак, метод предимплантационной генетической диагностики является дополнением ко всей программе ЭКО

Не стоит обращать внимание на стоимость процедуры. Если уже найдены деньги на само ЭКО, то остальные необходимые средства – это мизер

Здоровье ребенка не стоит такой экономии.

Методы ПГД

Врачи практикуют четыре способа ПГД. Это FISH, CGH, PCR, NGS. Рассмотрим их по отдельности.

Метод FISH

Еще fish-метод помогает:

  1. Осуществить ПГД эмбрионов, которые являются носителями хромосомных перестроек.
  2. Делать скрининг-исследование по часто встречающимся анеуплоидиям хромосом.
  3. Сразу определять пол планируемого ребенка.

Методы анализа кариотипа человека. Стандартные цитогенетические, молекулярно-цитогенетические, молекулярные методы

Метод PCR

Он позволяет правильно диагностировать болезни, которые возникают по причине доминантных и рецессивных мутаций (например, такие заболевания как муковисцидоз, гемофилия). PCR выявляет хромосомные нарушения, определяет антигены HLA и принадлежность эмбрионов по резусу. Методика ПЦР проверяет и близких родственников. То есть, кроме диагностики родителей, делают исследование родни на наличие моногенных заболеваний. Такие действие необходимы для выявления генных нарушений у эмбрионов.

Метод NGS

Расшифруем: Now-Generation Sequencing. Переводится как высокопроизводительное секвенирование. Это самая инновационная диагностика. При NGS проверяют последовательность ДНК, тем самым точно устанавливают генетическую патологию. Новая технология постепенно вытесняет первую методику FISH и находит обширное применение в зарубежных центрах ЭКО. Практика показала, что успех наступает в 70% случаев.

1. Метод Пона — Линдера — Харта

Метод
используется для определения ширины
зубных рядов у детей в сменном и постоянном
прикусе. Пон (Pont) установил наличие
зависимости между суммой мезиодистальных
размеров резцов и шириной зубного ряда
в области первых премоляров и моляров,
которую он выразил премолярным и молярным
индексами: 80 и 64. Эта зависимость отражена
в следующих формулах:

Методы анализа кариотипа человека. Стандартные цитогенетические, молекулярно-цитогенетические, молекулярные методы

Измерительными
точками на верхней челюсти являются:
середина продольных фиссур первых
премоляров и передняя точка пересечения
продольных и поперечных фиссур первых
моляров.

Методы анализа кариотипа человека. Стандартные цитогенетические, молекулярно-цитогенетические, молекулярные методы

Рис.
8. Измерительные точки для изучения
моделейчелюстей

Измерительные
точки на нижней челюсти — дистальная
точка первого премоляра, соприкасающаяся
со вторым премоляром (точка между
премолярами), и срединная точка на
вестибулярной поверхности или
дистально-щечный бугор первого премоляра
(рис. 8, а, б).

Указанные
измерительные точки, по данным Пона,
используют при постоянном прикусе. В
сменном прикусе вместо измерительных
точек премоляров берут дистальные
ямочки первых времен-

ных
моляров на верхней челюсти или их
дистально-буккальные бугры на нижней
челюсти.

В
тех случаях, когда не все верхние резцы
прорезались (или отсутствуют), сумму их
ширины можно определить по сумме
поперечных размеров нижних резцов,
используя индекс Тона (1,35), согласно
которому сумма ширины верхних резцов
относится к сумме нижних как 4/3.

Для
практических целей Пон составил таблицу
расстояний между премолярами и молярами
при различной ширине четырех верхних
резцов. Для нижней челюсти сумму
поперечных размеров четырех резцов и
соответствующие расстояния между
премолярами и молярами берут из таблицы
верхней челюсти (табл. 3).

Немецкие
ортодонты Линдер и Харт проверили данные
Пона и установили, что она не может быть
применима при обследовании немецких
детей в силу влияния расовых особенностей.
К аналогичному выводу пришла Н. Г. Снагина
при обследовании детей русской
национальности, поэтому указанные
авторы предлагают вместо предложенных
Поном коэффициентов 80 и 64 пользоваться
коэффициентами 85 и 65.

Таблица
3

Зависимость
ширины зубных рядов от суммы резцов

Методы анализа кариотипа человека. Стандартные цитогенетические, молекулярно-цитогенетические, молекулярные методы

Алгоритм
измерения модели верхней челюсти по
методу Пона — Линдера — Харта:

1. Определить
сумму ширины четырех резцов в самой
широкой их части, т. е. по режущему краю
(мм) с точностью до 0,1.

2. Подставить
в формулу Пона показатель ширины резцов,
а в знаменатель — индекс 85 (при определении
ширины резцов между премолярами) или
65 (при определении ширины между молярами),
вычислить искомые величины — ширину
зубной дуги между премо-лярами и молярами.
Искомую величину зубной дуги можно
также определить по табл. 3.

3. Найти
измерительные точки на первых премолярах
и измерить истинную ширину зубной дуги
между ними.

4. Найти
измерительные точки на первых молярах
и измерить истинную ширину зубной дуги
между ними.

5. Сравнить
истинную и искомую ширину зубной дуги
(между премолярами и молярами).

6. Оценить
полученные результаты: если при тесном
положении передних зубов сужение зубного
ряда в области премоляров и моляров
больше 6 мм, показано удаление отдельных
зубов. Удаление показано также в следующих
ситуациях:

ПОЛЕЗНАЯ ИНФОРМАЦИЯ:  Можно ли забеременеть от самой себя Как происходит зачатие

а) если
при тесном положении резцов центральные
резцы больше 10 мм, боковые — больше 7,5
мм, сумма ширины резцов составляет 35 мм
и более;

б) если
при узком типе лица сумма ширины резцов
больше 33 мм.

Насколько точна процедура ПГД

Преимплантационная диагностика доказала свою точность. Вероятность возможной ошибки не превышает 5%. Кроме этого, после наступления беременности женщине назначают и проводят комбинированные скрининги. Если вдруг они дадут недопустимый процент хромосомных отклонений, ей проводят инвазивную пренатальную диагностику.

Две стороны ПГД: положительная и отрицательная

Если говорить о положительной стороне, то это:

  1. Возможность сразу установить и «заказать» пол ребенка.
  2. Получение здорового малыша, благодаря подсадке только хорошего материала.
  3. Повредить зародыш очень трудно, риск составляет менее 1%.
  4. Возможность предотвращения конфликта разус-факторов.
  5. Исключается аборт по причине выявленных генетических отклонений.
  6. Процедура совершенно безвредна для эмбриона. На этой стадии развития клетки полностью взаимозаменяемы. Взятые для процедуры бластомеры легко замещаются новыми.
  7. Успешность программы ЭКО повышается в несколько раз.
  8. Врожденные пороки практически полностью исключаются.
  9. Отличная возможность помочь родной сестре или брату, благодаря подбору необходимого совместимого материала.

Плюсы процедуры ПГД перед ЭКО впечатляют, но минусы ЭКО тоже существенны. Отрицательная сторона проявляется в следующих факторах:

  1. Небольшой, но все же, риск повреждение зародыша. От него не избавишься и он может наступить.
  2. Вероятность получения неправильных результатов. Иногда здоровые эмбрионы принимаются за нездоровые. Их отсеивают в сторону. Получается, что в матку подсаживают материал с неправильной информацией. Чтобы исключить такой негативный фактор, проводят скрининг, который позволяет выявить подобную информацию на достаточно раннем сроке беременности.
  3. Присутствует риск в 3-5 % получения нездорового малыша.
  4. Процедура ПГД очень дорогая.

Методы анализа кариотипа человека. Стандартные цитогенетические, молекулярно-цитогенетические, молекулярные методы

Грубая сила в действии путеводитель по методам на основе высокопроизводительного секвенирования и редактирования геномов на примере изучения Notch-сигналинга в развитии Т-клеток

Тарас Креславский, PhD

Postdoc, Institute of Molecular Pathology (Vienna)

Тарас Креславский — выпускник биофака 2001 года (бакалавриат). Магистратуру провёл под руководством Prof. Dr. Peter Walden (Tumor Immunology Group, Charite,
Medical Faculty of Humboldt University, Berlin).  В 2009 получил степень PhD в Гарварде. Там же остался первый постдок в Dana-Farber Cancer Research Institute в лаборатории Prof. Harald von Boehmer.

Арсенал молекулярно-биологических методов, и так всё время росший многие годы, последние несколько лет, кажется, переживает «большой взрыв». Количество новых методов зашкаливает, а представлять принципы основных из них нужно если не для собственной работы, то хотя бы чтобы понимать чужие статьи. Два направления росли особенно бурно.

Во-первых, падение цен на секвенирование нового поколения привело к лавинообразному расширению спектра применений этой технологии. Посмотреть, что меняется в транскриптоме ваших любимых клеток после какого-то воздействия? Разобраться, где на ДНК или РНК сидит тот или иной белок? Понять, какие петли образует ДНК в ядре? Сделать multiplexed RNAi screening чтобы выяснить, какие гены важны в том или ином процессе? Всё это и многое другое теперь делается с применением высокопроизводительного секвенирования.

Во-вторых, открытие TALE и, особенно, CRISPR/Cas произвело революцию в нашей способности модифицировать геномы – как в спектре модельных организмов, чьи геномы можно теперь «редактировать», так и в скорости и удобстве работы с менее изученными объектами. Сделать мышь-knockout сразу по пяти генам за пару месяцев – фантастика? Нет, говорят, теперь можно.

«Мой основной профессиональный опыт лежит в области «клеточной» иммунологии, и все эти новомодные методы свалились на голову, как снежный ком. Некоторыми приходится пользоваться, в других нужно разобраться, чтобы понимать литературу. А чтобы разбираться было не скучно – я решил, что лучше сделать это в компании с вами, прочтя этот курс. Для того, чтобы весь рассказ не свёлся к сухому перечислению методов, я попробую «нанизать» их на реальную биологическую проблему, над которой мы работаем – изучение молекулярных механизмов, с помощью которых Notch-сигналинг запускает программу развития Т-лимфоцитов».

Будем благодарны за любую помощь в распространении информации (репосты ; объявления). Большое спасибо!

Лекция состоится в Главном здании СПбГУ (Университетская наб., д. 7/9; вход с Менделеевской линии; 2 этаж). При входе необходимо предъявить паспорт или другой документ.

Ссылка на основную публикацию